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斑馬魚(yú)基因敲除突變體建立


1.敲除原理

  功能缺失---基因敲除 (Gene Knockout)

  基因敲除 :將斑馬魚(yú)基因改變成無(wú)功能性基因(無(wú)效等位基因:null allele)的一種遺傳學(xué)技術(shù)

  【A gene knockout (KO) is a genetic technique in which one of an organism‘s genes is made inoperative. http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_knockout 】

  通過(guò)將基因敲除的個(gè)體與正常個(gè)體相比較,研究者可以揭示特定基因的功能。

  基因敲除技術(shù)特點(diǎn):在基因組水平上將目標基因修改成無(wú)效等位基因,遺傳背景干凈清晰,是研究基因功能的金標準。

 

2.服務(wù)流程

3.服務(wù)信息

流程分布

周期(工作日)

提交內容

基因信息分析

2

專(zhuān)業(yè)分析報告

sgRNA合成

9

獲得sgRNA并提供sgRNA合成階段報告

sgRNA活性驗證

5-10

獲得有活性的sgRNA并提供活性報告

F0代突變體鑒定

40

獲得F0代突變體并提供鑒定報告

F1代突變體獲得

60

提供2尾(或以上)F1代突變體并提供總結報告

總周期:4-5個(gè)月

 

 

 

 

案例說(shuō)明
案例展示

案例說(shuō)明

利用CRISPR技術(shù)建立動(dòng)物基因敲除突變體的實(shí)驗流程

(以斑馬魚(yú)基因為例)

  一、基因結構及功能的生物信息學(xué)分析

  二、CRISPR 設計

  三、目標序列的野生型等位基因的測序驗證

  3.1 擴增目標基因組片段的引物設計

  3.2 基因組DNA模板制備

  以斑馬魚(yú)為例,隨機選取5枚24 hpf胚胎,以《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》(南京堯順禹生物科技有限公司)制備斑馬魚(yú)基因組DNA模板。

  3.3 PCR產(chǎn)物電泳及測序驗證

  四、sgRNA體外表達模板的制備(質(zhì)粒模板法)

  本實(shí)驗流程以南京堯順禹生物科技公司的二合一質(zhì)粒pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA(含sgRNA骨架的質(zhì)粒)質(zhì)粒特征所設計。

  4.1 CRISPR寡核苷酸DNA(Oligo)對的設計

  4.2 向可信賴(lài)的商業(yè)公司訂購上述DNA引物(共2條,每個(gè)2 OD,RPC純化即可)。

  4.3 將正反向兩個(gè)引物進(jìn)行退火

  4.4 將退火產(chǎn)物與線(xiàn)性化的pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA骨架質(zhì)粒連接

  4.5 轉化

  4.6 轉化子鑒定

  2%瓊脂糖凝膠電泳,陽(yáng)性克隆應出現113 bp的條帶(圖1):

  

 

圖1:PCR驗證陽(yáng)性克隆。Lane1:DNA Marker (從下往上, 100bp, 250 bp, 500bp, 750 bp, 1000bp, 3000bp, 5000bp);Lane 2-4: 陰性轉化子; Lane 5-9: 陽(yáng)性轉化子

  4.7 測序驗證

  送2個(gè)經(jīng)PCR驗證有陽(yáng)性條帶的菌液去商業(yè)公司測序,測序引物為F-sgRNA,確認CRISPR序列(去除PAM位點(diǎn))和骨架序列重組到pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA質(zhì)粒中;同時(shí),將同樣的細菌接種在10 ml含氨芐青霉素的LB管中,37oC條件下?lián)u菌過(guò)夜。

  4.8 質(zhì)粒抽提

  4.9 sgRNA模板的制備

  以上述質(zhì)粒為模板,選用引物F-sgRNA和引物R-sgRNA作為一對引物,用高保真DNA聚合酶,通過(guò)PCR的方式,進(jìn)行sgRNA模板的制備。

  五、sgRNA體外轉錄

  用Maxiscript T7 Kit (Ambion)試劑盒,按說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行sgRNA的體外轉錄。

  說(shuō)明:由于sgRNA在細胞內發(fā)揮作用的是RNA的形式,因而不需要戴帽以及加尾等操作。

  5.1 20 ml體外轉錄體系(依次加入)

  sgRNA模板:12 ml

  10mM ATP: 1 ml (NTP均需在冰上溶解)

  10mM CTP: 1 ml

  10mM GTP: 1 ml

  10mM UTP: 1 ml

  T7 RNA polymerase:2 ml

  10 × Transcription Buffer:2 ml (先在室溫下溶解,然后Vortex,再離心后使用)

  5.2 將上述溶液充分混勻后,離心,然后置于37℃水浴鍋中孵育1h。

  5.3 向反應體系中加入1ml DNase I,混勻,再次于37℃水浴鍋中孵育15min。

  5.4 向反應體系中加80 ml DEPC處理過(guò)的超純水,10 ml 無(wú)RNase的3M醋酸鈉(pH5.2),渦旋混勻,然后加300 ml 無(wú)RNase的無(wú)水乙醇(購買(mǎi)來(lái)未打開(kāi)過(guò)的新的無(wú)水乙醇可視為無(wú)RNase,于-20℃中驟冷1小時(shí)以上。

  5.5 4℃,12000g 離心20min,棄上清。

  5.6 以70% 無(wú)RNase的乙醇清洗沉淀,4℃,12000g 離心5min,棄上清。

  5.7 然后再快速離心,將掛在離心管壁上的液體用移液器小心吸出。

  5.8 通風(fēng)櫥中(打開(kāi)抽氣開(kāi)關(guān))干燥(20min左右),若較長(cháng)時(shí)間仍不能將沉淀物干燥,再次于4℃,12000g 離心5min,將掛在離心管壁上的液體用移液器(小量程的移液器)小心吸出。

  5.9 加10 ml DEPC處理超純H2O 溶解沉淀。

  5.10 取0.5 ml sgRNA用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測轉錄出的sgRNA條帶的完整性(圖2),并用紫外分光光度計測量轉錄出的sgRNA的濃度。

  5.11 合成出的sgRNA應及時(shí)進(jìn)行分裝,保存在-80oC冰箱中,不要反復凍融,以免影響其質(zhì)量。

  

 

圖2、sgRNA (第2條泳道為sgRNA)

  六、sgRNA活性的測試

  將上述sgRNA和Cas9 蛋白混合,顯微注入斑馬魚(yú)受精卵,注射量為1nl。待胚胎發(fā)育至7-24 hpf時(shí),取5枚胚胎,使用本公司生產(chǎn)的《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》制備基因組DNA模板,方法同前。

  然后以引物對F-gene和R-gene進(jìn)行PCR擴增,將PCR產(chǎn)物分別亞克隆到pGEM-T Easy載體中。以引物對T7和Sp6對轉化子進(jìn)行擴增,以篩選驗證。

  對篩選到的陽(yáng)性轉化子,以T7和Sp6擴增產(chǎn)物為模板,F-gene和R-gene再次進(jìn)行PCR擴增。然后,依據條帶大小,選20個(gè)克隆,5個(gè)一組,PCR產(chǎn)物等量混合后直接送測序。直接閱讀測序圖,只要其中任何一組出現有套峰,即假定制備的sgRNA活性不小于5%(1/20)。

  

 

圖4 典型的測序套峰圖

  七、斑馬魚(yú)靶向基因突變體F0代的建立

  將上述經(jīng)過(guò)驗證有活性的sgRNA和Cas9 蛋白等量混合后,按上述相同的方法顯微注入斑馬魚(yú)受精卵。然后將按常規飼養,當生長(cháng)至兩月齡時(shí),剪取尾鰭,按前述同樣的方法進(jìn)行擴增目標基因組DNA片段。將獲得的PCR產(chǎn)物直接送測序,確認體細胞含靶向突變。然后將斑馬魚(yú)飼養至性成熟,共獲得約50尾后代。

  

 

圖5 典型的體細胞含靶向突變的測序套峰圖

  八、斑馬魚(yú)基因靶向突變F1代的制備

  收取F0自交的胚胎,獲得不少于100尾以上的F1。將F1按常規飼養至2個(gè)月時(shí),選取10尾魚(yú),剪尾鰭,按前述方法進(jìn)行基因型鑒定。簡(jiǎn)單地說(shuō),用南京堯順禹生物科技有限公司的《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》制備基因組DNA模板,再以引物對F-gene和R-gene進(jìn)行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物直接送測序,通過(guò)直接讀測序的色譜圖,確認每一位魚(yú)是否攜帶等位基因突變。

  九、基因靶向突變體的擴群建系

  將攜帶基因靶向突變的F1突變體和野生型交配,獲得F2群,完成基因靶向突變體的建系擴群。

參考文獻
參考文獻

參考文獻

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