科研服務(wù)
SCIENTIFIC SERVICE
斑馬魚(yú)基因敲除突變體建立
1.敲除原理
功能缺失---基因敲除 (Gene Knockout)
基因敲除 :將斑馬魚(yú)基因改變成無(wú)功能性基因(無(wú)效等位基因:null allele)的一種遺傳學(xué)技術(shù)
【A gene knockout (KO) is a genetic technique in which one of an organism‘s genes is made inoperative. http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_knockout 】
通過(guò)將基因敲除的個(gè)體與正常個(gè)體相比較,研究者可以揭示特定基因的功能。
基因敲除技術(shù)特點(diǎn):在基因組水平上將目標基因修改成無(wú)效等位基因,遺傳背景干凈清晰,是研究基因功能的金標準。
2.服務(wù)流程
3.服務(wù)信息
流程分布 |
周期(工作日) |
提交內容 |
基因信息分析 |
2 |
專(zhuān)業(yè)分析報告 |
sgRNA合成 |
9 |
獲得sgRNA并提供sgRNA合成階段報告 |
sgRNA活性驗證 |
5-10 |
獲得有活性的sgRNA并提供活性報告 |
F0代突變體鑒定 |
40 |
獲得F0代突變體并提供鑒定報告 |
F1代突變體獲得 |
60 |
提供2尾(或以上)F1代突變體并提供總結報告 |
總周期:4-5個(gè)月 |
案例說(shuō)明
案例說(shuō)明
X利用CRISPR技術(shù)建立動(dòng)物基因敲除突變體的實(shí)驗流程
(以斑馬魚(yú)基因為例)
一、基因結構及功能的生物信息學(xué)分析
二、CRISPR 設計
三、目標序列的野生型等位基因的測序驗證
3.1 擴增目標基因組片段的引物設計
3.2 基因組DNA模板制備
以斑馬魚(yú)為例,隨機選取5枚24 hpf胚胎,以《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》(南京堯順禹生物科技有限公司)制備斑馬魚(yú)基因組DNA模板。
3.3 PCR產(chǎn)物電泳及測序驗證
四、sgRNA體外表達模板的制備(質(zhì)粒模板法)
本實(shí)驗流程以南京堯順禹生物科技公司的二合一質(zhì)粒pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA(含sgRNA骨架的質(zhì)粒)質(zhì)粒特征所設計。
4.1 CRISPR寡核苷酸DNA(Oligo)對的設計
4.2 向可信賴(lài)的商業(yè)公司訂購上述DNA引物(共2條,每個(gè)2 OD,RPC純化即可)。
4.3 將正反向兩個(gè)引物進(jìn)行退火
4.4 將退火產(chǎn)物與線(xiàn)性化的pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA骨架質(zhì)粒連接
4.5 轉化
4.6 轉化子鑒定
2%瓊脂糖凝膠電泳,陽(yáng)性克隆應出現113 bp的條帶(圖1):
圖1:PCR驗證陽(yáng)性克隆。Lane1:DNA Marker (從下往上, 100bp, 250 bp, 500bp, 750 bp, 1000bp, 3000bp, 5000bp);Lane 2-4: 陰性轉化子; Lane 5-9: 陽(yáng)性轉化子
4.7 測序驗證
送2個(gè)經(jīng)PCR驗證有陽(yáng)性條帶的菌液去商業(yè)公司測序,測序引物為F-sgRNA,確認CRISPR序列(去除PAM位點(diǎn))和骨架序列重組到pYSY-T7-Cas9-T7-sgRNA質(zhì)粒中;同時(shí),將同樣的細菌接種在10 ml含氨芐青霉素的LB管中,37oC條件下?lián)u菌過(guò)夜。
4.8 質(zhì)粒抽提
4.9 sgRNA模板的制備
以上述質(zhì)粒為模板,選用引物F-sgRNA和引物R-sgRNA作為一對引物,用高保真DNA聚合酶,通過(guò)PCR的方式,進(jìn)行sgRNA模板的制備。
五、sgRNA體外轉錄
用Maxiscript T7 Kit (Ambion)試劑盒,按說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行sgRNA的體外轉錄。
說(shuō)明:由于sgRNA在細胞內發(fā)揮作用的是RNA的形式,因而不需要戴帽以及加尾等操作。
5.1 20 ml體外轉錄體系(依次加入)
sgRNA模板:12 ml
10mM ATP: 1 ml (NTP均需在冰上溶解)
10mM CTP: 1 ml
10mM GTP: 1 ml
10mM UTP: 1 ml
T7 RNA polymerase:2 ml
10 × Transcription Buffer:2 ml (先在室溫下溶解,然后Vortex,再離心后使用)
5.2 將上述溶液充分混勻后,離心,然后置于37℃水浴鍋中孵育1h。
5.3 向反應體系中加入1ml DNase I,混勻,再次于37℃水浴鍋中孵育15min。
5.4 向反應體系中加80 ml DEPC處理過(guò)的超純水,10 ml 無(wú)RNase的3M醋酸鈉(pH5.2),渦旋混勻,然后加300 ml 無(wú)RNase的無(wú)水乙醇(購買(mǎi)來(lái)未打開(kāi)過(guò)的新的無(wú)水乙醇可視為無(wú)RNase,于-20℃中驟冷1小時(shí)以上。
5.5 4℃,12000g 離心20min,棄上清。
5.6 以70% 無(wú)RNase的乙醇清洗沉淀,4℃,12000g 離心5min,棄上清。
5.7 然后再快速離心,將掛在離心管壁上的液體用移液器小心吸出。
5.8 通風(fēng)櫥中(打開(kāi)抽氣開(kāi)關(guān))干燥(20min左右),若較長(cháng)時(shí)間仍不能將沉淀物干燥,再次于4℃,12000g 離心5min,將掛在離心管壁上的液體用移液器(小量程的移液器)小心吸出。
5.9 加10 ml DEPC處理超純H2O 溶解沉淀。
5.10 取0.5 ml sgRNA用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測轉錄出的sgRNA條帶的完整性(圖2),并用紫外分光光度計測量轉錄出的sgRNA的濃度。
5.11 合成出的sgRNA應及時(shí)進(jìn)行分裝,保存在-80oC冰箱中,不要反復凍融,以免影響其質(zhì)量。
圖2、sgRNA (第2條泳道為sgRNA)
六、sgRNA活性的測試
將上述sgRNA和Cas9 蛋白混合,顯微注入斑馬魚(yú)受精卵,注射量為1nl。待胚胎發(fā)育至7-24 hpf時(shí),取5枚胚胎,使用本公司生產(chǎn)的《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》制備基因組DNA模板,方法同前。
然后以引物對F-gene和R-gene進(jìn)行PCR擴增,將PCR產(chǎn)物分別亞克隆到pGEM-T Easy載體中。以引物對T7和Sp6對轉化子進(jìn)行擴增,以篩選驗證。
對篩選到的陽(yáng)性轉化子,以T7和Sp6擴增產(chǎn)物為模板,F-gene和R-gene再次進(jìn)行PCR擴增。然后,依據條帶大小,選20個(gè)克隆,5個(gè)一組,PCR產(chǎn)物等量混合后直接送測序。直接閱讀測序圖,只要其中任何一組出現有套峰,即假定制備的sgRNA活性不小于5%(1/20)。
圖4 典型的測序套峰圖
七、斑馬魚(yú)靶向基因突變體F0代的建立
將上述經(jīng)過(guò)驗證有活性的sgRNA和Cas9 蛋白等量混合后,按上述相同的方法顯微注入斑馬魚(yú)受精卵。然后將按常規飼養,當生長(cháng)至兩月齡時(shí),剪取尾鰭,按前述同樣的方法進(jìn)行擴增目標基因組DNA片段。將獲得的PCR產(chǎn)物直接送測序,確認體細胞含靶向突變。然后將斑馬魚(yú)飼養至性成熟,共獲得約50尾后代。
圖5 典型的體細胞含靶向突變的測序套峰圖
八、斑馬魚(yú)基因靶向突變F1代的制備
收取F0自交的胚胎,獲得不少于100尾以上的F1。將F1按常規飼養至2個(gè)月時(shí),選取10尾魚(yú),剪尾鰭,按前述方法進(jìn)行基因型鑒定。簡(jiǎn)單地說(shuō),用南京堯順禹生物科技有限公司的《超微量基因組DNA模板制備試劑盒》制備基因組DNA模板,再以引物對F-gene和R-gene進(jìn)行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物直接送測序,通過(guò)直接讀測序的色譜圖,確認每一位魚(yú)是否攜帶等位基因突變。
九、基因靶向突變體的擴群建系
將攜帶基因靶向突變的F1突變體和野生型交配,獲得F2群,完成基因靶向突變體的建系擴群。
參考文獻
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